Количественная оценка кардиотонических гликозидов
Количественную оценку качества сырья проводят методом биологической стандартизации (для всех видов) или с использованием физико-химических методов анализа (для сырья, из которого получают индивидуальные кардиотонические гликозиды).
Биологическая стандартизация основана на способности кардиотонических гликозидов вызывать в токсических дозах систолическую остановку сердца животных. Активность сердечных средств оценивают в сравнении с активностью стандартных препаратов и выражают в единицах действия (ЕД). Испытания проводят на животных определенной массы и пола: лягушках (ЛЕД), голубях (ГЕД), кошках (КЕД). Устанавливают наименьшие дозы стандартного образца и исследуемого препарата (сырья), вызывающие систолическую остановку сердца подопытных животных. Затем рассчитывают содержание единиц действия в 1 г исследуемого средства (если это лекарственные растения или сухие концентраты), в одной таблетке (при испытании таблеток), в 1 мл (для жидких лекарственных форм).
Стандартными образцами могут быть специально изготовленные спиртовые экстракты, содержащие сумму гликозидов и очищенные от сопутствующих веществ (наперстянка пурпурная и крупноцветковая, ландыш майский) или индивидуальные кристаллические гликозиды: целанид-стандарт (наперстянка шерстистая); цимарин-стандарт (горицвет весенний); строфантин-G-стандарт (строфанты); эризимин-стандарт (желтушник раскидистый (ж. серый)). Отбор животных, их содержание, техника испытания описаны в ГФ XI, а также в частных ФС на лекарственное растительное сырье.
Физико-химические методы основаны на сочетании хроматографического разделения очищенного экстракта, полученного из сырья, элюировании индивидуальных гликозидов и их количественном определении различными методами (фотоэлектроколориметрическим, спектрофотометрическим, флуориметрическом и др.). Физико-химические методы не всегда дают результаты, совпадающие с результатами, полученными путем определения биологической активности, так как они позволяют определить не молекулу гликозида в целом, а обычно какую-то ее часть (лактонное кольцо, стероидную структуру, углеводный компонент); не учитывают характер сочленения колец, ориентацию функциональных групп, характер углеводного компонента и т.д.
Источник
Качественное определение сердечных гликозидов в растительном сырье
Для обнаружения сердечных гликозидов в растительных экстрактах используют цветные реакции, которые можно разделить на три группы:
| Реакции на углеводную часть молекулы (на дезоксисахара) | Реакции на стероидное ядро | Реакция на ненасыщенное лактонное кольцо (пятичленное) |
| — Реакция Келлера-Килиани | -реакция Либермана-Бурхарда; -реакция Розенгейма | -Реакция Легаля (с нитропруссидом натрия) -Реакция Раймонда (с м-динитробензолом) -Реакция Балье (с пикриновой кислотой) -Реакция Кедде (с 3,5-динитробензойной кислотой) |
В анализе сердечных гликозидов используют также УФ-, ИК-, спектроскопию.
Количественное определение сердечных гликозидов в лекарственном растительном сырье
Методы, которыми пользуются для количественного определения кардиогликозидов можно разделить на 2 группы.
Физико-химические методы
Наиболее простыми и доступными считаются фотометрические методы: фотокалориметрия и спектрофотометрия в видимой области спектра. Эти методы основаны на цветных реакциях сердечных гликозидов с различными нитросоединениями.
Флуориметрические методы основаны на способности сердечных гликозидов флуоресцировать под действием сильных кислот концентрированные серная, фосфорная кислоты и окислителей (перхлорат железа, хлорное железо) после кратковременного облучения УФ светом.
Поляграфические методы основаны на способности сердечных гликозидов восстанавливаться на ртутно-капельном электроде при потенциалах 1,9-2 В, образуя диффузные токи, волны которых пропорциональны концентрации сердечных гликозидов.
В последнее время все чаще применяется метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ)
Биологические методы
Нормативно-техническая документация на лекарственное растительное сырье наряду с физическими методами количественного определения требует обязательной стандартизации сырья биологическими методами.
Биологическая стандартизация проводится на животных: лягушках, кошках, голубях. Этот метод основан на способности сердечных гликозидов вызывать в токсических дозах систолическую остановку сердца.
Одна лягушачья единица действия (ЛЕД) соответствует наименьшей дозе стандартного препарата, вызывающей систолическую остановку сердца стандартной лягушки (лягушка-самец массой 28-33 г) Под одной кошачьей или голубиной единицей действия (1 КЕД или 1 ГЕД) подразумевают дозу стандартного препарата, вызывающей систолическую остановку сердца из расчета на 1 кг массы животного.
В НТД на лекарственное сырьё, содержащее сердечные гликозиды, обязательно указывают валор.
Валор сырья — это количество единиц действия в 1 г сырья. Для этого устанавливают наименьшие дозы стандартного образца и испытуемого препарата, вызывающие систолическую остановку сердца у животных. Затем рассчитывают содержание единиц в 1 г испытуемого лекарственного растения.
Ни один из вышеперечисленных методов количественного определения сердечных гликозидов не является идеальным. Количественное определение таких лабильных веществ, сердечные гликозиды, нуждается в индивидуальном подходе в каждом конкретном случае.
ТЕМА 2: ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ
Цель занятия: научиться определять подлинность и доброкачественность лекарственного сырья, содержащего сердечные гликозиды.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ
1. Напишите латинские названия сырья, растения и семейства предложенных для изучения растений.
2. Укажите места обитания и культивирования предложенных для изучения растений.
3. Перечислите основные сердечные гликозиды и другие классы БАВ предложенных для изучения растений.
4. Используя учебные пособия, перечислите основные морфологические признаки производящих растений.
5. Укажите правила сбора и сушки сырья. Как может изменяться биологическая активность сердечных гликозидов при сборе, сушке и хранении лекарственного сырья?
6. Перечислите фармакологические свойства, медицинское применение и препараты предложенных для изучения растений.
7. Для закрепления знаний заполните в лабораторном журнале таблицу:
| Лек. растение | Сердечные гликозиды | Химическая формула | Другие классы БАД, содержащиеся в ЛРС | Медицинское применение | Препараты |
Список лекарственных растений, содержащих кардиогликозиды
Лекарственные растения, содержащие карденолиды типа наперстянки
1. Digitalis purpurea(наперстянка пурпуровая).
Сем.: Scrophulariaceae (Норичниковые)
Сырье: Folia Digitalis
2. Digitalis grandiflora(наперстянка крупноцветковая).
Сем.: Scrophulariaceae (Норичниковые)
Сырье: Folia Digitalis
3. Digitalis lanata (наперстянка шерстистая)
Сем.: Scrophulariaceae (Норичниковые)
Сырье: Folia Digitalis lanatae
Лекарственные растения, содержащие карденолиды типа строфанта
4. Convallaria majalis (ландыш майский)
Сем.: Convallariaceae (Ландышевые)
Сырье: Folia Convallariae
5. Adonis vernalis (горицвет весенний)
Сем.: Ranunculaceae (Лютиковые).
Сырье: Herba Adonidis vernalis
6. Strophanthus kombe (строфант Комбе).
Сем.: Apocynaceae (Кутровые)
Сырье: Semina Strophanthi
7. Erysimum diffusum=Erysimum canescens
(желтушник раскидистый)=(желтушник седеющий)
Cем.: Brassicaceae (Крестоцветные)
Сырье: Herba Erysimi recens
Лекарственные растения, содержащие буфадиенолиды
8. Urginea maritime= Scilla maritime (морской лук)
Сем.: Liliaceae (Лилейные)
Сырье: Bulbus Scillae (Высушенные внутренние чешуи луковиц)
9. Helleborus purpurascens (Морозник краснеющий)
Сем.: Ranunculaceae (Лютиковые).
Сырье: Rhizomata cum radicibus Hellebori purpurascentis
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ
Задание 1. Изучение морфолого-анатомических признаков листьев наперстянки пурпурной
Используя наглядные пособия, данные ГФ, учебных пособий, справочного материала изучите производящее растение и лекарственное растительное сырье по предложенному плану и оформите по схеме.
При описании внешних признаков обратите внимание на:
· форму листовой пластинки;
· жилкование листовой пластинки;
· край листовой пластинки;
· особенность строения черешка у прикорневых листьев.
При описании микродиагностических признаков обратите внимание на:
· количество, характер и расположение простых волосков;
· типы головчатых волосков.
Задание 2. Изучение макродиагностических признаков листьев наперстянки крупноцветковой
Используя наглядные пособия, данные ГФ, учебных пособий, справочного материала изучите производящее растение и лекарственное растительное сырье по предложенному плану и оформите по схеме.
При описании внешних признаков обратите внимание на:
· форму листовой пластинки;
· жилкование листовой пластинки;
· край листовой пластинки;
· особенность строения черешка.
Обратите внимание, что ГФ XI предусматривает использование наперстянки крупноцветковой только в цельном виде.
Задание 3. Изучение макродиагностических признаков листьев наперстянки шерстистой
Используя наглядные пособия, данные ГФ, учебных пособий, справочного материала изучите производящее растение и лекарственное растительное сырье по предложенному плану и оформите по схеме.
При описании внешних признаков обратите внимание на:
· форму и характер листовой пластинки (листья слегка кожистые);
· жилкование листовой пластинки и окраску жилок;
· край листовой пластинки;
· отсутствие опушения листовой пластинки;
· особенность строения черешка.
Задание 4. Сравнительная характеристика внешних признаков производящих растений и лекарственного растительного сырья различных видов наперстянок
На основании изучения морфологических признаков производящих растений и листьев наперстянок заполните предложенную таблицу
| Признак | D. purpurea | D.grandiflora | D. lanata |
| Жизненная форма | |||
| Форма листовой пластинки | |||
| Край листовой пластинки | |||
| Жилкование | |||
| Опушение листовой пластинки | |||
| Цвет листовой пластинки (верхней и нижней сторон) | |||
| Соцветие | |||
| Особенности строения цветка | |||
| Окраска венчика |
►Обратите внимание на другие виды наперстянок, разрешенных к использованию в медицинских целях.
Помимо упомянутых видов, разрешены к использованию наперстянка реснитчатая (Digitalis ciliata), от которой заготавливают траву и наперстянка ржавая (Digitalis ferruginea), сырьем которой являются листья.
►Обратите внимание на примеси.
Примесью к наперстянке пурпуровой, не подлежащей заготовке, является наперстянка испанская (Digitalis thapsi) дико произрастающая в Испании и Италии, имеющая листья от ланцетных до овальных с неравномерно-зубчатым краем до 15 см длиной и 5 см шириной.
Задание 5. Изучение морфолого-анатомических признаков листьев ландыша майского
Используя наглядные пособия, данные ГФ, учебных пособий, справочного материала изучите производящее растение и лекарственное растительное сырье по предложенному плану и оформите по схеме.
Источник
Сердечные гликозиды
Сердечными гликозидами называют гликозиды, агликоны которых являются производными циклопентанпергидрофенантрена, содержащие в положении 17 ненасыщенное лактонное кольцо и обладающие кардиотоническим действием.
Общая структура сердечных гликозидов имеет следующий вид:
Первое научное упоминание о том, что некоторые растения обладают стимулирующим действием на работу сердца, принадлежит Уайтерингу (1785 г). Этот эффект он обнаружил, изучая действие листьев наперстянки. В 1856 г появилась работа доктора Кирка о том, что кардиотоническим действием обладает так называемый “стрельный яд”, получаемый некоторыми африканскими племенами из строфанта и использующийся ими для смазывания наконечников стрел при охоте. В 1865 г профессор Петербургской медико-хирургической академии Пеликан провел глубокое фармакологическое исследование “стрельного яда” из строфанта и подтвердил его избирательное действие на сердечную мышцу. Через 7 лет после этого Фразер выделил из строфанта индивидуальное биологически активное соединение и показал его гликозидную структуру, но подробно расшифровать химическую структуру сердечного гликозида из строфанта удалось только в 1937 г.
Первыми растениями отечественной флоры, в которых были обнаружены кардиотонические вещества, явились горицвет весенний и ландыш майский (1860-1861 гг). Однако химическая структура биологически активных соединений из этих растений была расшифрована только в 1960 г. группой ученых под руководством Д.Г. Колесникова.
Следует отметить, что с момента открытия сердечных гликозидов и по настоящее время ассортимент растений, содержащих сердечные гликозиды и использующихся в медицинской практике, почти не изменился. В то же время сердечные гликозиды, как лекарственные вещества, не имеют себе равных синтетических заменителей и растения служат единственным источником их получения. Почти в 80% случаев при лечении сердечно-сосудистых заболеваний используют препараты растительного происхождения.
Основным эффектом сердечных гликозидов является их избирательное действие на сердце. Под их влиянием изменяется целый ряд параметров функционирования сердечной мышцы.
Важнейшими кардиальными эффектами являются следующие:
1. Положительный инотропный эффект — систола становится более короткой и мощной. При этом важным обстоятельством является то, что усиление работы сердца происходит без увеличения потребления кислорода сердечной мышцей.
2. Отрицательный хронотропный эффект — урежаются сердечные сокращения (удлиняется диастола). Сочетание мощной систолы и удлиненной диастолы создает экономный режим работы сердца и способствует восстановлению энергетических ресурсов в миокарде.
3. Отрицательное дромотропное действие — прямое торможение скорости проведения импульсов в сердечной мышце, а рефрактерный период увеличивается. При этом в больших дозах сердечные гликозиды могут вызвать предсердно-желудочковый блок.
4. Положительное батмотропное действие – в зависимости от дозы сердечные гликозиды либо повышают возбудимость отдельных участков миокарда (дозы, близкие к терапевтическим), либо угнетают.
5. Повышение автоматизма работы сердца – приводит к образованию эктопических дополнительных очагов возбуждения, генерирующих импульсы не зависимо от главного водителя ритма – синусового узла. При этом возникают нарушения ритма сердечной деятельности (экстрасистолы).
Распространение сердечных гликозидов в растительном мире.
Растения, содержащие сердечные гликозиды, немногочисленны: из 434 семейств цветковых растений, произрастающих на Земле, кардиотонические вещества обнаружены только в 15 семействах. Из 160 семейств флоры СНГ — только в 9 семействах. Несмотря на то, что выделены и изучены около 400 различных сердечных гликозидов, в медицинской практике используется их небольшая часть — около 12. Преимущественным содержанием сердечных гликозидов отличаются семейства Liliaceae, Ranunculaceae, Apocinaceae, Scrophulariaceae.
Сердечные гликозиды находятся в растворенном виде в клеточном соке листьев, семян и т.д.
Биогенез сердечных гликозидов. Биогенетическим предшественником кардиотонических гликозидов является сквален (см. Биогенез терпеноидов»), который образуется путем соединения «хвост к хвосту» двух молекул фарнезилпирофосфата
Классификация сердечных гликозидов.
Существуют несколько видов классификаций сердечных гликозидов, основанных на следующих принципах:
1. Строение лактонного кольца у С-17. В зависимости от строения лактонного кольца различают группу карденолидов — у С-17 содержится a, b-ненасыщенный пятичленный лактон; и группу буфадиенолидов, имеющую шестичленное дважды ненасыщенное лактонное кольцо:
Большинство растений, продуцирующих сердечные гликозиды, содержат карденолиды. Из 400 известных сердечных гликозидов около 380 карденолиды. Разумеется, они же в большей степени используются в медицинской практике.
2. Конформационные особенности строения стероидного скелета. Кольца А и В стероидного скелета могут иметь как цис- так и транс-сочленения. Кольца В и С всегда имеют только транс-сочленение, а кольца С и D — только цис-сочленение. Следовательно, сердечные гликозиды в зависимости от типа сочленения колец А и В могут разделяться на транс-А/В-ряд (или ряд холестана) и цис-А/В-ряд (ряд копростана). Фармакологической активностью обладают сердечные гликозиды только копростанового ряда.
3. Структура заместителей в положении С-10 (R3) стероидного скелета. В зависимости от характера заместителей у С-10 сердечные гликозиды разделяют на группу наперстянки — агликоны в 10-м положении содержат метильный радикал (-СН3); и группу строфанта — в этом положении содержат альдегидную группу (-СНО).
В фармакологическом плане эти две группы различаются тем, что гликозиды группы наперстянки достаточно хорошо всасываются в желудочно-кишечном тракте, медленно выводятся из организма и обладают кумулятивным эффектом. Гликозиды группы строфанта наоборот, обладают плохой всасываемостью в желудочно-кишечном тракте, не кумулируют и быстро выводятся из организма.
4. Степень растворимости в воде или липидах. Способность к взаимодействию сердечных гликозидов (точнее, их агликонов) с водой или липидами, является определяющим фактором их фармакологической активности. Это объясняется различной скоростью всасывания соединений в желудочно-кишечном тракте и скоростью фильтрации почками, возможностью образовывать устойчивые комплексы с белками плазмы крови и желчными кислотами, а также некоторыми другими фармакокинетическими особенностями.
Растворимость химических веществ в тех или иных средах определяется их степенью полярности.
По этому признаку сердечные гликозиды разделяют на следующие группы:
а) Полярные гликозиды. К этой группе относятся препараты строфанта, ландыша майского, адониса весеннего и желтушника раскидистого. Их агликонами являются строфантидин и его аналоги, имеющие в своей структуре четыре гидрофильные группы, сообщающие агликону достаточно выраженные гидрофильные свойства.
| К-строфантидин |
Полярные гликозиды хорошо растворяются в воде, но плохо в липидах. В связи с этим они плохо всасываются слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта (применяют преимущественно парантерально), но легко выводятся через почки. Кардиотонический эффект развивается уже через 5-10 мин. Высокая скорость наступления эффекта объясняется тем, что полярные сердечные гликозиды мало связываются с белками плазмы крови и быстро распределяются в организме. Не кумулируют и обладают наименьшей длительностью действия (до 24 ч).
б) Неполярные сердечные гликозиды. К этой группе относятся гликозиды наперстянки пурпуровой и крупноцветковой. Агликоном является дигитоксигенин, содержащий только две свободные гидрофильные группы.
| Дигитоксигенин |
Эта группа сердечных гликозидов плохо растворима в воде и хорошо — в липидах, поэтому обладает высокой всасываемостью в кишечнике (применяют преимущественно перорально). Кардиотонический эффект наступает через 2-4 ч после приема. Неполярные сердечные гликозиды поступают в печень, выделяются с желчью в кишечник, а затем вновь реабсорбируются (т.н. кишечно-печеночная циркуляция), что значительно увеличивает продолжительность действия препаратов. Неполярные сердечные гликозиды активно связываются с белками плазмы крови и плохо фильтруются через почки. Все это приводит к высокой степени кумуляции в организме и максимальной продолжительности действия (до 10-14 дней).
в) Относительно полярные гликозиды – промежуточные соединения между полярной и неполярной группами.К ним относятся гликозиды наперстянки шерстистой. Агликон дигоксигенин имеет три свободные гидрофильные группы.
Эта группа веществ относительно хорошо растворима как в липидах, так и в воде, поэтому достаточно хорошо всасывается при приеме внутрь, но и хорошо выводится через почки. Способна связываться с белками плазмы крови (но значительно менее активно, чем неполярные гликозиды), следовательно, умеренно кумулировать и действовать до 5-7 дней. Препараты относительно полярных сердечных гликозидов могут применяться как парантерально, так и перорально.
Строение сахарного компонента сердечных гликозидов. На биологическую активность сердечных гликозидов оказывает влияние не только строение агликона, но и природа углеводного остатка. В большинстве случаев сахарный компонент присоединяется к агликону по месту расположения спиртового гидроксила у С-3, построен линейно и может составлять от одного до пяти монозидов (см. тему «Гликозиды»). Гликозиды с сахарными остатками L-ряда значительно активнее гликозидов с сахарными остатками D-ряда.
Физико-химические свойства сердечных гликозидов. Сердечные гликозиды в основном представляют собой кристаллические вещества, бесцветные, горького вкуса. Имеют фиксированные точку плавления и угол вращения.
Сердечные гликозиды мало растворимы в органических растворителях, но растворимы в смеси хлороформ-спирт; плохо растворимы в воде, но хорошо растворимы в водных растворах этилового или метилового спирта. Растворимость в воде повышается с увеличением длины углеводной цепи.
Агликоны сердечных гликозидов хорошо растворимы в органических растворителях.
Растворы сердечных гликозидов обладают специфической флуоресценцией в УФ свете.
Сердечные гликозиды способны к кислотному, щелочному и ферментативному гидролизу. Условия кислотного гидролиза зависят от строения углеводной цепи: если агликон связан непосредственно с дезоксисахарами (в большинстве соединений к агликону сначала присоединяется дезоксисахар, а терминальной молекулой является глюкоза), то кислотный гидролиз протекает достаточно легко и агликоны не претерпевают деструкции. Если агликон связан с “нормальным” сахаром, то такие гликозиды гидролизуются в жестких условиях и при этом, как правило, происходит разрушение лактонного кольца.
При ферментативном гидролизе происходит ступенчатое отщепление сахарных компонентов и из генуинных (первичных) гликозидов образуются вторичные с более короткой углеводной цепью. Например, первичный гликозид наперстянки пурпурной — пурпуреагликозид А содержит в качестве сахарного компонента углеводную цепь, состоящую из 3 молекул дигитоксозы и 1 терминальной молекулы глюкозы.
При отщеплении молекулы глюкозы в результате ферментативного гидролиза образуется достаточно устойчивое соединение дигитоксин, используемое в качестве лечебного препарата.
Следует отметить, что деструкция сахарного компонента сердечных гликозидов легко протекает в естественных условиях, например, при заготовке и первичной переработке сырья, когда собранное сырье согревается и содержащиеся в нем ферменты активизируются. В то же время образование вторичных и даже третичных гликозидов из генуинных — далеко не всегда желаемый процесс и для его ограничения сушку сырья, содержащего сердечные гликозиды проводят не позднее 1 ч после сбора сырья при температуре 55-60 о С.
Выделение сердечных гликозидов из растительного сырья.
Основная трудность при выделении сердечных гликозидов заключается в их высокой лабильности. В связи с этим все операции по изоляции сердечных гликозидов проводят в строго выдерженном температурном и рН-режиме. Если необходимо получить не нативные, а вторичные гликозиды, то предварительно проводят ферментативный гидролиз.
К числу наиболее удобных и эффективных способов выделения сердечных гликозидов из лекарственного растительного сырья можно отнести следующий.
Навеску суховоздушного сырья обрабатывают 80% этанолом в течение суток при 0-2 о С и из полученного извлечения спирт удаляют упариванием под вакуумом при температуре не выше 50 о С. Водное извлечение обрабатывают четыреххлористым углеродом и смесь разделяют на делительной воронке. Органическую фазу отбрасывают, как содержащую сопутствующие вещества (хлорофилл, смолы, каротиноиды и др.), а очищенный от балластных веществ водный экстракт подвергают колоночной хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента смесь хлороформа и изопропилового спирта в соотношении 3:1. Фракции, содержащие сердечные гликозиды, объединяют и упаривают под вакуумом. Полученный сухой остаток, содержащий сумму сердечных гликозидов, растворяют в 70% этаноле. Индивидуальные сердечные гликозиды можно выделить перекристаллизацией из полученного суммарного извлечения.
Качественный анализ сердечных гликозидов. Для обнаружения сердечных гликозидов используются 3 группы цветных реакций — реакции на сахарный компонент, на стероидное ядро и реакции на лактонный цикл.
1. Реакции с сахарным компонентом. С помощью этих реакций можно определить, относится ли исследуемое вещество к гликозидам, и к какой группе сахаров принадлежит сахарный компонент. Реакции, как правило, проводят после кислотного гидролиза сердечных гликозидов. Наличие образовавшихся “нормальных” моносахаридов определяют с помощью реактива Фелинга или реакцией серебрянного зеркала. Дезоксисахара дают позитивную реакцию Келлер-Килиани — спиртовый раствор сахара в ледяной уксусной кислоте, содержащей следовые количества треххлористого железа, при наслаивании на концентрированную серную кислоту приобретает ярко голубой или сине-зеленый цвет.
Часто качественный анализ сахаров сочетают с предварительной хроматографией гидролизата на бумаге или пластинках Силуфол. При проявлении хроматограмм анилинфталатом пятна моносахаров приобретают буро-красный цвет.
2. Реакции на стероидный цикл. Реакция Либермана-Бурхарда: сухой остаток очищенного извлечения гликозида растворяют в ледяной уксусной кислоте, прибавляют смесь уксусного ангидрида с концентрированной серной кислотой (50:1) — развивается красно-розовое окрашивание, переходящее в зеленое.
Реакция Розенгейма: сухой остаток очищенного извлечения гликозида растворяют в хлороформе и смешивают с 90% водным раствором трихлоруксусной кислоты. Появляются сменяющие друг друга окраски от розовой до лиловой и интенсивно синей.
3. Реакции на лактонное кольцо. К этому ряду реакций относятся реакция Легаля — с нитропруссидом натрия развивается красное окрашивание; реакция Балье — с пикриновой кислотой развивается оранжевое окрашивание; реакция Раймонда — с м-динитробензолом развивается фиолетовое окрашивание.
Количественное определение сердечных гликозидов. С целью количественного определения сердечных гликозидов в сырье используют физико-химические методы после очистки суммы сердечных гликозидов или выделения индивидуальных веществ; спектрофотометрические, фотоэлектроколориметрические, полярографические, флуориметрические. Часто в качестве предварительного этапа количественного определения используют хроматографию на колонках, бумаге или в тонком слое.
Существенным недостатком вышеперечисленных методов количественного определения сердечных гликозидов является то обстоятельство, что оценка проводится, как правило, по одному из компонентов молекулы гликозида (стероидному циклу или лактонному кольцу), и не учитывается целостность всего соединения, как необходимое условие для проявления стандартной биологической активности.
Действительно, в процессе переработки сырья, его хранения, выделении индивидуальных соединений, химическая структура гликозидов претерпевает некоторые изменения: происходит частичное разрушение лактонного цикла, варьирует длина углеводной цепи и т.д. Следовательно, различные молекулы сердечных гликозидов, содержащиеся в препарате, будут обладать и различной силой фармакологического эффекта. По этой причине дозировать лекарственные формы, содержащие сердечные гликозиды, основываясь только на данных о содержании сердечных гликозидов, полученных вышеуказанными способами, не представляется возможным.
Для препаратов растительного сырья и препаратов, содержащих сердечные гликозиды, обязательным является биологическое тестирование.
В основу биологического метода контроля положено токсическое действие сердечных гликозидов на организм животного, в результате которого наступает систолическая остановка сердца. Биологическая стандартизация проводится на лягушках (наиболее часто), кошках или голубях. Активность оценивают по сравнению со стандартным кристаллическим препаратом и выражают в единицах действия (ЛЕД, КЕД или ГЕД). Одна лягушачья единица действия (ЛЕД) соответствует наименьшей дозе стандартного препарата, вызывающей систолическую остановку сердца стандартной лягушки в течение 1 ч, если испытывают сырье и препараты наперстянки, ландыша и горицвета; или 2 ч, если испытывают сырье и препараты строфанта и желтушника.
На лекарственное растительное сырье, содержащее гликозиды, обязательно указывается валор. Валор сырья — это количество ЕД в 1 г лекарственного растительного сырья.
Биологическая стандартизация сырья и препаратов, содержащих сердечные гликозиды, также не лишена недостатков, и главные из них — дороговизна, высокая трудоемкость и не высокая точность.
Источник
Свойства и стандартизация сердечных гликозидов
Дигитоксин, дигоксин и строфантин К представляют собой белые или бесцветные кристаллические вещества, коргликон — порошок от светло-жёлтого до буровато-жёлтого цвета (табл. 48.5). Они мало растворимы или практически нерастворимы в воде.
48.5. Свойства лекарственных препаратов сердечных гликозидов
| Источник получения | Лекарственный препарат | Описание и растворимость |
| Листья ландыша майского (Convallaria majalis L.) и его разновидности семейства ландышевых (Convallariaceae) | Corglycon— коргликон (смесь гликозидов) | Порошок от светло-жёлтого до буровато-жёлтого цвета. Трудно растворим в воде, легко — в этаноле, практически нерастворим в эфире и хлороформе |
| Наперстянка пурпурная (Digitalis purpurea L.) и наперстянка шерстистая (Digitalis lanata Ehrh.) | Digitoxin— дигитоксин | Белый кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, мало растворим в этаноле, трудно — в хлороформе. Удельное вращение от +16 до +19 ° (1%-ный раствор в хлороформе) |
| Наперстянка шерстистая (Digitalis lanata Ehrh.), сем. норичниковых (Scrophulariaceae) | Digoxin— дигоксин | Белый кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, очень мало — в этаноле и хлороформе, растворим в метаноле |
| Семена строфанта комбе (Strophanthus kombe Oliver), сем. кутровых (Apocynaceae) | Strophanthin K— строфантин К (смесь гликозидов) | Белый или белый со слегка желтоватым оттенком порошок. Трудно растворим в воде и этаноле, практически нерастворим в эфире и хлороформе |
Объективную оценку подлинности сложных по химической структуре индивидуальных сердечных гликозидов позволяет сделать ИК-спектр, снятый после прессования в таблетках с бромидом калия в области 4000-400 см –1 . Этот метод рекомендован ФС для дигоксина. Спектр должен быть идентичен спектру стандартного образца дигоксина, снятому в тех же условиях.
Для установления подлинности сердечных гликозидов могут быть использованы общие химические реакции. Первая группа цветных реакций позволяет обнаружить наличие стероидного цикла в молекуле, например реакция Либермана — Бурхардта. Она основана на способности стероидов к дегидратации под действием уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты. В результате реакции слой уксусного ангидрида окрашивается в зеленый цвет. ФС рекомендует эту реакцию для установления подлинности коргликона и строфантина К. Стероидный цикл в карденолидах обнаруживают флуориметрическим методом, используя в качестве реактива смесь фосфорной и серной кислот с хлоридом железа (III), раствор перхлората железа в серной кислоте и др. Реакции приемлемы тогда, когда анализируемый гликозид в результате дегидрирования образует окрашенные моно- или диангидридопроизводные. ФС рекомендует для обнаружения сердечных гликозидов в строфантине К реакцию с концентрированной серной кислотой (зеленое окрашивание).
Вторая группа цветных реакций основана на обнаружении пятичленного лактонного цикла с двойной связью в a,b-положении в молекуле карденолидов. К их числу относится реакция Легаля, суть которой заключается в образовании окрашенного в красный цвет продукта при взаимодействии сердечного гликозида с раствором нитропруссида натрия в щелочной среде. Эту реакцию ФС рекомендуют для испытания подлинности всех указанных лекарственных препаратов сердечных гликозидов. Пятичленный лактонный цикл можно также обнаружить по образованию окрашенных в красно-фиолетовый цвет продуктов взаимодействия с нитропроизводными ароматического ряда в щелочной среде, например, с м-динитробензолом (реакция Раймонда). Эту реакцию ФС рекомендует для обнаружения агликона в молекуле дигитоксина. Разновидностью данной группы реакций является образование окрашенных в оранжево-красный цвет продуктов взаимодействия сердечных гликозидов со щелочным раствором пикриновой кислоты (реакция Балье):
Третья группа реакций основана на обнаружении сахарного компонента в сердечных гликозидах. Для этой цели могут быть использованы свойственные сахарам реакции, основанные на их восстановительных свойствах (реакция с реактивом Фелинга, реакция «серебряного зеркала» и др.). Но наиболее широко применяют специфичную на 2-дезоксисахара (содержащиеся в молекулах большинства сердечных гликозидов) реакцию Келлера — Килиани. Из различных способов ФС рекомендует методику, заключающуюся в предварительном растворении 1–2 мг гликозида в ледяной уксусной кислоте, содержащей 0,05%-ного хлорида железа (III). Раствор осторожно вливают в пробирку с концентрированной серной кислотой и наблюдают окраску верхнего слоя, подтверждающую наличие в молекуле сахара — дигитоксозы (сине-зеленый цвет) и наличие агликона — дигитоксигенина по окраске на границе двух слоев (лилово-красной или бурой). Этим способом устанавливают подлинность дигитоксина.
Дезоксисахара можно обнаружить с помощью ксантгидрола (реакция Пезеца). При нагревании ксантгидрола (дибензо-g-пиранола) с испытуемым гликозидом в присутствии ледяной уксусной кислоты и последующем прибавлении нескольких капель серной или фосфорной кислоты появляется красное окрашивание. Аналогичную цветную реакцию дает антрон. Методика основана на образовании фурфурола или его производных из сахарных компонентов под действием концентрированной серной кислоты. Фурфурол с антроном затем дает продукт конденсации, окрашенный в зеленый или сине-зеленый цвет:
Подлинность сердечных гликозидов можно подтвердить по удельному вращению (табл. 48.5). Методом ТСХ устанавливают подлинность коргликона. На пластинке с закреплённым слоем силикагеля в смеси бензол-бутанол (1:1) разделяют компоненты, входящие в состав лекарственного препарата. После проявления м-динитробензолом должно быть не менее 5 пятен синего цвета, соответствующих конваллозиду, конваллятоксину, локундьезиду, конваллятоксолу и дезглюкохейротоксину. Для идентификации сердечных гликозидов и их агликонов перспективен способ, основанный на построении хроматографических диаграмм, которые выражают зависимость величин Rf от системы растворителей (В.П. Георгиевский с сотр.).
При испытании на чистоту лекарственных препаратов сердечных гликозидов определяют потерю в массе при высушивании, сульфатную золу и тяжёлые металлы, прозрачность и цветность растворов, но особое внимание следует обращать на наличие примеси посторонних гликозидов.
В соответствии с требованиями ФС в дигитоксине, гитоксине и строфантине К примеси других гликозидов устанавливают методом ТСХ на пластинках с закрепленным слоем силикагеля или с обращённой фазой. Хроматографируют восходящим методом в системе растворителей различного состава. Проявляют хлорамином Б или м-динитробензолом. О наличии примесей судят по совокупности величины и интенсивности окраски (флуоресценции) пятен в УФ-свете или значении их Rf. В дигитоксине устанавливают спектрофотометрическим методом по оптической плотности при длине волны 352 нм примеси гитоксина (не более 5%) и сапонинов (по реакции осаждения холестерином). В коргликоне по ФС устанавливают отсутствие примеси дубильных веществ (по отрицательной цветной реакции с ионом железа (III)) и сапонинов (по отсутствию стойкой пены после взбалтывания).
Применение спектрофотометрии для идентификации и количественного определения сердечных гликозидов оказалось возможным благодаря избирательному поглощению в УФ-области спектра (215–220 нм), обусловленному наличием в агликонах a, b-ненасыщенного лактонного цикла. Например, количественно определить дигитоксин можно при длине волны 215 и 219 нм.
Кроме того, сердечные гликозиды определяют в щелочной среде, фотометрируя окрашенные продукты их взаимодействия с нитропроизводными ароматического ряда. Значения молярных показателей поглощения образующихся окрашенных комплексов (чувствительность реакций) находятся в зависимости от химической структуры нитропроизводных: с 2,4-динитродифенилсульфоном 24600–24800, с пикриновой кислотой 14000–18800, с 3,5-динитробензойной кислотой 6000–9700. Наиболее широко применяют в качестве реактива пикриновую кислоту или пикрат натрия (реакция Балье) для определения дигитоксина, дигоксина, строфантина Г и др. Так, в соответствии с требованиями ФС для количественного определения коргликона, дигитоксина и строфантина К используют спектрофотометрию в видимой области спектра (495±1 нм). Измеряют оптическую плотность раствора образовавшегося пикрата относительно спиртового раствора пикриновой кислоты. Параллельно в тех же условиях получают и измеряют оптическую плотность пикрата стандартного образца. По нему рассчитывают содержание дигитоксина (95-105%). Содержание суммы сердечных гликозидов в строфантине К и коргликоне вычисляют по калибровочному графику. Строфантин К должен содержать не менее 80% гликозидов (в пересчёте на цимарин), а коргликон — 30-50% (в пересчёте на конваллятоксин).
Качественную и количественную оценку сердечных гликозидов выполняют также с помощью метода ВЭЖХ, отличающегося высокой чувствительностью и позволяющего определить не только основные, но и сопутствующие гликозиды, например в 0,05%-ном растворе строфантина К для инъекций. Этот метод дает результаты, сопоставимые с биологическим контролем. ФС на дигоксин рекомендует метод ВЭЖХ для установления подлинности по идентичности времени удерживания основного пика на хроматограммах растворов испытуемого и стандартного образцов. Количественное содержание дигоксина определяют с помощью жидкостного хроматографа со спектрофотометрическим детектором, при длине волны 220 нм. Содержание дигоксина вычисляют по измеренным площадям пиков испытуемого и стандартного образцов.
Биологическим методом активность устанавливают сравнением с препаратами-стандартами и выражают в ЛЕД (лягушачьих), КЕД (кошачьих) или ГЕД (голубиных) единицах действия. При биологическом методе контроля устанавливают наименьшие дозы стандартного и испытуемого лекарственного препарата, которые вызывают систолическую остановку сердца подопытных животных. Затем рассчитывают содержание единиц действия (ЕД) в 1,0 г исследуемого препарата, в одной таблетке или в 1 мл раствора (ГФ XI, вып. 2, с. 163). Этот метод ФС рекомендуют для оценки лекарственных препаратов, 1,0 г которых должен содержать строфантина К (43000-58000 ЛЕД или 5800-7100 КЕД, или 3827-4773 ГЕД), дигитоксина (8000-12000 ЛЕД или 1900-2400 ГЕД), коргликона (19000-27000 ЛЕД или 3030-3700 КЕД). Недостаток биологического контроля — трудоемкость, длительность и малая точность. Нередко его сочетают с применением физико-химических методов.
Ряд сердечных гликозидов и их лекарственных форм могут быть определены полярографическим методом. Достоинство этого метода заключается в том, что определение выполняется за счет восстановления двойной связи, сопряженной с карбонильной группой лактонного цикла. Эта система, как известно, является одним из факторов, обусловливающим биологическую активность сердечных гликозидов. Еще более широкие возможности достигаются при применении полярографии в сочетании с предварительным хроматографическим разделением.
Хранение и применение
Лекарственные препараты сердечных гликозидов хранят по списку А, в хорошо укупоренной таре, предохраняющей от действия света и влаги (коргликон — при температуре не выше +5 °C). Такие условия позволяют не допускать их гидролитического расщепления.
Большое влияние на стабильность гликозидов, особенно в растительном сырье, оказывают ферменты. Поэтому при его хранении и получении лекарственных веществ ферменты необходимо инактивировать. Это достигается путём высушивания сырья при 40-60 °C или обработки его парами этанола, эфира, хлороформа. После этого стабильность гликозидов значительно повышается.
Сердечные гликозиды, как правило, являются нейтральными соединениями. Они чувствительны к воздействию как кислот, так и щелочей. Под влиянием кислот, даже таких слабых, как уксусная, происходит отщепление легко гидролизуемых 2-дезоксисахаров, являющихся составными компонентами сердечных гликозидов. В щелочной среде происходит необратимая изомеризация карденолидов или расщепление лактонного цикла с образованием фармакологически неактивных соединений. Под влиянием щелочи в лактонном цикле может происходить перемещение двойной связи из a-b положения в b-g положение. Процесс гидролиза гликозидов сопровождается последовательным отщеплением моносахаридов, входящих в состав сахарного компонента. Установить стабильность сердечных гликозидов можно по отсутствию восстановительной способности, т.к. у них замещён полуацетальный гидроксил.
Сердечные гликозиды применяют в качестве кардиотонических средств при острой и хронической недостаточности кровообращения или сердечно-сосудистой недостаточности. Отличаются они по силе, продолжительности, скорости проявления действия, влиянию на центральную нервную систему.
Наиболее эффективны эти лекарственные препараты при внутривенном введении. Для этого их предварительно растворяют в 20–40%-ном растворе глюкозы или в изотоническом растворе до 0,025%-ной концентрации. Высшие разовые дозы индивидуальных сердечных гликозидов составляют 0,5 мг, суточные — 1,0 мг. Передозировка вызывает резкое нарушение сердечной деятельности. Это обусловило необходимость их включения в список А. Следует учитывать способность сердечных гликозидов постепенно накапливаться в организме (степень кумуляции).
Источник